در حال حاضر برای سلول­های پستانداری غالباً از سیستم­های ادغام تصادفی برای ترانسفکشن استفاده می­شود که منجر به ایجاد یک پول سلولی می­شود که دارای انواع سلول­ها با سایت­های غیرقابل پیش­بینی ادغام کروموزومی، تعداد کپی نامشخص، و بیان پروتئین ناهمگن، هستند. درنتیجه تلاش زیادی برای غربالگری لازم است تا سلولی با تولید بالا از میان پول سلولی انتخاب شود. یکی از مهمترین مراحل روند توسعه یک رده سلولی، روش “انتخاب کلون” است که برای شناسایی انواع مطلوب از میان انواع مختلف و ناهمگون سلول­های ترانسفکت شده (پول سلولی) به کار می­رود.

 البته روش­های ادغام هدفمند نیز وجود دارند، اما از لحاظ تولید با تعداد ترجمه­های ژنی بالا، قابل رقابت با روش­های استانداردی که چندین کپی از ژن را ترانسفکت می­کنند، نیستند. هر چند روش­های هدفمند مزایایی مانند بیان همگن ژنی و تولید کلون­های پایدار دارند، چون ممکن است در اثر ادغام کپی زیاد از ژن در سلول، خاموش کردن ژنی در برخی مناطق اتفاق بیفتد. همچنین، با ساده­سازی مرحله انتخاب، توسعه رده سلولی در زمان کمتری اتفاق می­افتد. به هر حال امروزه اکثراً روش­های ادغام تصادفی مورد استفاده قرار می­گیرند که تاثیرگذاری مرحله “انتخاب کلون مطلوب” را افزایش می­دهد.

علاوه بر اثرات غیر قابل پیش­بینی ادغام تصادفی، رده­های سلول CHO، مانند دیگر رده­های نامیرا، در معرض تنوع کلونی ژنوتیپی و فنوتیپی هستند. این موضوع برای تولید در یک محیط صنعتی نامطلوب است، زیرا برای تولید داروهای بیولوژیکی که در انسان استفاده می­شوند، رده­های سلولی کلونال (که برگرفته از یک سلول منفرد هستند) مورد نیاز هستند تا عملکرد تکرارپذیر و دارای صحت و دقت مناسب داشته باشند (شکل 1).

در سال‌های اخیر اثبات کلونالیته (تک کلون بودن) به کانون توجه FDA و سایر مقامات نظارتی تبدیل شده است. بسیاری از شرکت­ها در طول فرآیند بررسی IND محصولات بیولوژیکی خود نظراتی را در مورد این موضوع دریافت کرده­اند. اگرچه به صراحت در هیچ سند نظارتی این مساله صراحتا ذکر نشده است، توسعه بانک­های سلولی کلونال در ICH Q5D و EMA/CHMP ارجاع شده است. به عبارت دیگر، این موضوع علاوه بر این که در قوانین مربوط به FDA مورد توجه هست، بر راندمان تولید پروتئین مورد نظر هم تاثیر زیادی دارد. به دلیل اینکه برای تولید پروتئین­ها انرژی متابولیکی سلول مصرف می­شود، سلول­هایی که تولید پروتئین نوترکیب کمتری داشته باشند، انرژی اضافه را مصرف نمی­کنند، و در طول دوره رشد دارای مزیت تکاملی شده و در نتیجه به تدریج در جمعیت غالب خواهند شد. بنابراین، برای تولید پایدار و زیاد پروتئین نوترکیب منطبق بر قوانین، مرحله “انتخاب” مهم است.

شکل 1: نموداری نمادین به منظور مقایسه تاثیر ناهمگونی جمعیت سلول مولد بر افزایش بازه تغییرات پارامترهای ماده تولید شده.

انواع روش­های مورد استفاده جهت تهیه تک کلون

ساده‌ترین روش برای ارائه احتمالی بالا از کلونالیته یک بانک سلولی، مستندسازی رسوب میکروتیتری یک سلول منفرد در چاهک کشت سلول، یا بوسیله مرتب‌سازی سلولی (FACS)، و یا استفاده از روش محدودیت رقت و تصاویر گرفته شده در ابتدایی‌ترین مرحله ممکن در طول توسعه رده سلولی است. در شکل 2 به صورت مختصر مقایسه­ای از ویژگی­ها و همچنین مزایا و معایب هر روش نمایش داده شده است.

شکل 2. مقایسه ویژگی­ها و مزایا و معایب دو روش معمول تهیه تک کلون

روش محدودیت رقت از قدیمی­ترین و رایج­ترین روش­های مورد استفاده است. در این روش سلول­ها در پلیت­های 96تایی به نحوی تقسیم می­شوند که از لحاظ آماری در هر چاهک، حداکثر یک سلول قرار بگیرد. پس از قرار دادن سلول­ها لازم است تا سپس هر چاهک با دقت بررسی شده و تعداد سلول­های زنده در آن مشخص می­شوند. با نگهداری پلیت در انکوباتور، چاهک­هایی که دارای کلون­هایی باشند که از یک سلول مشتق شده­اند، برای آنالیزهای بعدی مورد استفاده قرار خواهند گرفت. در برخی مقالات پخش اولیه سلول­ها به نحوی صورت گرفته که به هر خانه کمتر از یک سلول (تا نیم سلول) برسد. به این ترتیب، اطمینان بیشتری از تک کلون بودن سلول­های نهایی داریم. این روش هر چند قدیمی و بسیار زمان­بر (از 6 تا 8 ماه) است ولی به دلیل سهولت و در دسترس بودن هم چنان مورد استفاده قرار می­گیرد.

در سال­های اخیر، ابزارهای تخصصی و رباتیک برای مرتب‌سازی سلولی، تصویربرداری و چاپ سلولی در دسترس شرکت‌های دارویی قرار گرفته‌اند تا روند تک کلون نمودن با سرعت، دقت، و صحت بیشتری صورت بپذیرد. به عنوان مثال، دستگاه­هایی مانند VIPS و یا دستگاه­ها ارائه شده توسط شرکت Cytena (شکل 3)، با قرارگیری در زیر هود بیولوژیک، می­توانند به صورت خودکار محلول سلولی را که در اختیارشان قرار گرفته است، به نحوی بین هر چاهک تقسیم کنند که تنها یک سلول در هر چاهک قرار بگیرد. نکته قوت این دستگاه­ها، علاوه بر افزایش سرعت و دقت کار، مستندسازی تقسیم سلول­ها و روند رشد آنهاست که به صورت مستقیم قابل ارائه در اسناد مختلف هستند.

شکل 3. نمایی از دستگاه­های جدید و اتوماتیک برای تهیه تک کلون

نکته قابل ذکر در روند تهیه تک کلون این است که روش­های ذکر شده تنها تضمین مشتق شدن جمعیت سلولی از یک تک سلول را مورد توجه قرار می­دهند و در تمامی این روش­ها لازم است تا در مرحله­های بعد تعداد زیادی از این جمعیت­های تک کلون شده را مورد بررسی و غربالگری قرار داد تا به بهترین تک کلون رسید. حال اگر بتوان از ابتدا همان تک کلونی را که بیشترین بازده تولیدی را دارد انتخاب کرد، صرفه­جویی زیادی در زمان و هزینه مواد خواهیم داشت. به منظور تشخیص ماده تولید شده توسط سلول­ها می­توان یک ویژگی فلورسانس را به سلول اضافه کرد، به نحوی که سلول مطلوب که بیان نوترکیب بیشتری دارد فلورسانس بیشتری هم داشته باشد. اضافه کردن خاصیت فلورسانس، بدون استفاده از ژن جداگانه، و از طریق آنتی­بادی­ها نیز قابل انجام است. نکته قابل تامل این قسمت در مورد پروتئین­های تولید شده به صورت ترشحی است. در مورد این پروتئین­ها باید از روش­هایی استفاده کرد که پروتئین نوترکیب ترشح شده در اطراف غشای سلول باقی بماند. این کار را می­توان با قرار دادن سلول­ها در فضای نیمه سیال (میکرودراپلت های آگارزی یا هیدروژل های فعال با نور)، اتصال ثابت سلول­ها به سطح (با سرما یا با تمایل سطحی)، یا استفاده از پروتئین­های بین غشایی و furin cleavage peptide (RAKR) برای اتصال موقت پروتئین ترشح شده به غشای بیرونی سلول، انجام داد. هر کدام از این روش­ها نقاط ضعف خاص خود را دارند، مثلا آزاد کردن سلول­ها از آگارز ممکن است در زنده­مانی آنها موثر باشد.

پرکاربردترین روش انتخاب بهترین مولد به صورت تک کلون، روش ClonePix است که در آن سلول­های مولد در یک محیط نیمه سیال قرار می­گیرند و با اضافه کردن خاصیت فلورسانس به محصول تولیدی، دستگاه به صورت خودکار محیط حاوی سلول­ها را اسکن کرده و کلون­های با فلورسانس بیشتر که نشان­دهنده تولید بیشتر هستند، جدا کرده و کشت می­دهد (شکل 4).

شکل 4. نمایی از به کاری گیری روش ClonePix برای انتخاب تک کلون با بیشترین تولید.

تمام روش­های ذکر شده تاکنون، برای رده­های سلولی تولیدی جدید قابل اجرا هستند، اما در مورد رده­های سلولی که قبل از برقراری این مقررات تهیه شده و ایزوله شده باشند، کاربردی ندارند. برای این منظور، فناوری­های تکمیلی علاوه بر رویکردهای مستندسازی تک سلولی ذکر شده در بالا در دسترس هستند. این روش­ها شامل تکنیک‌های ساترن بلات برای تشخیص حضور ژن نوترکیب در بخش‌های ژنومی مشخص، PCR اتصالی یا تکثیر جایگاه هدف (TLA) برای شناسایی محل ادغام دقیق ژن، و هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH) (به طور بالقوه در ترکیب با رنگ‌آمیزی کروموزوم) برای تشخیص محل کروموزومی ژن نوترکیب است.

به طور کلی، تکنیک‌های قبلی بر ارائه داده‌هایی تمرکز می‌کنند که نشان­دهنده این باشند که یک رویداد ادغام منحصربه‌فرد و منفرد اتفاق افتاده است، و همچنین از نظر آماری نشان می‌دهند که تمام سلول‌ها با آن مکان و توالی ادغام خاص از یک کلون منفرد مشتق شده‌اند. در بیشتر موارد، بعید است که چندین سلول ژن مورد نظر را دقیقاً در یک مکان ادغام کرده باشند. با این حال، در مورد پروتکل‌های ادغام ژنی هدفمند، این رویکردها برای حمایت از کلونالیته شکست خواهند خورد. همچنین، برای کسانی که از سلول‌های CHO استفاده می‌کنند، مهم است که در نظر داشته باشند که ژنوم سلول‌های CHO به دلیل سرعت تقسیم سریع این سلول‌ها در کشت، دائماً با سرعت بالایی در حال تغییر است. این موضوع هم به وقوع بازآرایی‌های ژنومی مانند جابه‌جایی‌ها و SNP‌ها و هم به تغییرات در اپی ژنوم و رونوشت ژنوم، که بر رفتار سلول‌ها تأثیر می‌گذارد، مربوط می‌شود. در حالی که یک ساب کلون ممکن است به روش خاصی رفتار کند، اگر دوباره ساب کلون شود، ویژگی‌های ساب کلون‌های جدید ممکن است دوباره متفاوت از هم شوند در حالی­که همچنان همان محل ادغام ژنوم را حفظ می‌کنند. این موضوع باعث می‌شود که پروتکل‌هایی که به تنهایی به سایت‌های ادغام نگاه می‌کنند، برای تعیین تک‌کلونالیته غیرقابل اعتماد باشند. بنابراین، برای شناسایی قطعی کلونالیته و تبار سلولی (شناسایی ساب کلون مادری یا رده سلولی میزبان)، ابزارهای پیچیده­تری مورد نیاز است که ژنوم را با جزئیات بیشتری تجزیه و تحلیل کند. توالی یابی نسل بعدی (NGS) کل ژنوم یک ابزار قدرتمند است و در حال تبدیل شدن به روش انتخابی در ارائه شواهدی مبنی بر مونوکلونالیته برای بانک­های سلولی است.